LABORATÓRIUM SPEKTRÁLNYCH METÓD
Nová budova, B-blok, 5. poschodie, č. miestnosti 533, oddelenie Anorganickej chémie UACHTM FCHPT STU
Vedúci laboratória: doc. Ing. Peter Segľa, PhD.
Zástupca: Silvia Markusová
Laboratórium spektrálnych metód uskutočňuje identifikáciu neznámych látok, určovanie funkčných skupín, overovanie čistoty látok a stanovení ich obsahu v zmesiach. Laboratórium využíva infračervenú spektroskopiu v mnohých oboroch, a to v štruktúrnej analýze organických a anorganických materiálov, analýze cudzorodých látok v životnom prostredí, analýze polymérov, analýze farieb. Infračervené spektrometria sa využíva aj v analýze potravín, v medicíne, v ekológii a v priemyslovej analýze.
INFRAČERVENÁ SPEKTROMETRIA
Prístrojové vybavenie laboratória pre IČ spektrometriu
FTIR Spektrometer Nicolet 5700
FTIR Spektrometer Nicolet 5700 je variabilný spektrometrický systém vhodný pre najširšiu škálu analytických aplikácií. Jeho mimoriadne optické vlastnosti sú dané spojením najnovšej riadiacej technológie DSP (Digital Signal Processing) s vnútornou inteligenciou a jedinečným usporiadaním optickej lavice, ktorá umožňuje nepretržitú dynamickú optimalizáciu optickej dráhy. Vnútorná inteligencia zabezpečuje dlhodobú spektrálnu stabilitu, zobrazovanie spektier v reálnom čase, diagnostiku všetkých častí optickej lavice, výnimočný pomer signálu k šumu a okamžitú komunikáciu s užívateľom. Číp DSP neustále kontroluje funkciu interferometra a znemožňuje tak rozjustovanie optiky s časom. Interferometer Vectra systému Nicolet 5700 umožňuje spektrálne rozlíšenie 0,09 cm–1. Optická lavica spektrometra jed uspôsobená na uzavretie a vysušenie systémom Purge-Curtain (meranie vo FAR oblasti). Spektroskopický programový balík Omnic Professional 7.2 je variabilný software pre meranie, spracovanie a vyhodnocovanie spektier (kvalitatívna a kvantitatívna analýza).Volené optické komponenty spektrometra Nicolet 5700 umožňujú jeho využitie v oblasti merania od 50 do 13 500 cm–1. Spektrometer je optimalizovaný nielen pre jednotlivé spektrálne rozsahy, ale aj pre ich kombinácie. Príslušenstvo „Nicolet 5700 Smart Accesories“ – Nicolet Smart Orbit – jednoodrazové ATR s vysoko-účinným diamantovým kryštálom. Je to ideálny nástavec pre analýzu tvrdých, drsných, reaktívnych alebo korozívnych materiálov. Je použiteľný v širokom spektrálnom rozsahu od 50 do 10 000 cm–1. Nástavec firmy Specac umožňuje meranie do veľmi nízkych teplôt a zároveň monitorovať zmeny v IČ spektrách v závislosti od teploty.
Teoretické základy IČ spektrometrie
Infračervená spektrometria je analytická technika určená predovšetkým na identifikáciu a štruktúrnu charakterizáciu organických zlúčenín ako aj na stanovenie anorganických látek. Tato technika meria absorpciu infračerveného žiarenia rôznej vlnové dĺžky analyzovaným materiálom. Infračerveným žiarenie je elektromagnetické žiarenie v rozsahu vlnových dĺžok 0.78 – 1000 mm, ktoré odpovedá rozsahu vlnočtov 12800 – 10 cm–1. Celá oblast je rozdelená na blízku (13000 – 4000 cm–1), strednú (4000 – 200 cm–1) a ďalekú infračervenú oblasť (200 – 10 cm–1), pričom najpoužívanejšou je stredná oblasť.
Metóda je založená na absorpcií infračerveného žiarenia pri prechode vzorkou, pričom dochádza k zmenám rotačných a vibračných energetických stavov molekuly v závislosti na zmenách dipólového momentu molekuly. Analytickým výstupom je infračervené spektrum, které je grafickým zobrazením funkčnej závislosti energie, zväčša vyjadrená v percentách priepustnosti – transmitancie (T) alebo jednotkách absorbancie (A) na vlnovej dĺžke dopadajúceho žiarenia. Transmitancia (priepustnosť) je definovaná ako pomer intenzity žiarenia, ktoré prešlo vzorkou (I) k intenzite žiarenia vychádzajúceho zo zdroja (I0). Absorbancia je definovaná ako dekadický logaritmus 1/T. Závislost energie na vlnovej dĺžke je logaritmická, preto sa používa vlnočet, který je definovaný ako prevrátená hodnota vlnovej dĺžky a teda uvedená závislosť energie na vlnočtu bude lineárnou funkciou.
Absorpčné pásy, ktoré majú maxima v intervalu 4000 – 1500 cm–1 sú vhodné na identifikáciu funkčných skupín (např. –OH, C=O, N–H, CH3 a pod.). Pásy v oblasti 1500 – 400 cm–1 sa nazývajú oblastí „odtlačkov palca“ (fingerprint region). Pomocou „Search programov“ a digitalizovaných knihovni infračervených spektier je možné identifikovať neznámu analyzovanú látku. V súčasnej dobe sa objavujú softwery, ktoré umožňujú simulovať infračervené spektrum organických molekúl.
Infračervená spektroskopia je používaná k identifikácii chemickej štruktúry látok už od 30. rokov 20. storočia. Avšak spektrofotometre pracujúce na princípu rozkladu svetla (disperzné spektrofotometre) neumožňovali analýzu silne absorbujúcich matric. Analýza pevných vzoriek bola zväčša obmedzená na práškové materiály, které boli merané vo forme zmesi s halogenidmi alkalických kovov lisované do tenkých tabliet, alebo metódou kapilárnej vrstvy, suspenzie prášku v ľahkom alifatickom oleji medzi okienkami z monokrystalov halogenidov alkalických kovov alebo kovov alkalických zemin. Kvapalné aj plynné vzorky bolo možno merať v podstate bez obmedzenia. S rozvojom výpočtovej techniky v 80. rokoch 20. storočia dochádza k praktickému rozšíreniu infračervených spektrometrov s Fourierovou transformáciou (FTIR spektrometre). Ide o prístroje pracujúce na princípe interferencie žiarenia, ktoré na rozdiel od disperzných prístrojov meria interferogram modulovaného zväzku žiarenia po prechode vzorkou. Tieto prístroje vyžadujú matematickú metódu Fourierovej transformacie, aby sme získali klasický spektrální záznam. FTIR spektrometre majú celú radu výhod. Pri meraniu dopadá na detektor vždy celý zväzok žiarenia. Takéto usporiadanie umožňuje i experimenty, pri ktorých dochádza k veľkým energetickým stratám, tj. meranie silne absorbujúcich vzoriek alebo meranie s nástavcami pre analýzu pevných alebo kvapalných vzoriek v odrazenom svetle – reflektančná infračervená spektroskopia. Rozvoj FTIR spektrometrie umožnil i rozvoj infračervené mikroskopie.
Výber techniky a príprava vzorky na FTIR merania
Kvapalné vzorky
-
Najjednoduchšia cesta je meranie vzorky v kyvete o určitej hrúbke majúcej okienka z KBr alebo NaCl.
-
Ak je kvapalná vzorka nerozpustná v štandardne používaných rozpúšťadlách (CHCl3, CCl4, CS2), môže sa vo veľmi malom množstve merať transmisne vo forme kapilárnej vrstvy medzi dvomi KBr (NaCl) okienkami.
V poslednej dobe sa veľmi často uplatňuje technika metódy zoslabenia úplného odrazu (ATR).
Tuhé vzorky
-
Vzorky rozpustné v štandardne používaných rozpúšťadlách (CHCl3, CCl4) sú merané v bežných kyvetách určených pre kvapalné vzorky
-
Je možno aj pripraviť tenký film vzorky jeho rozpusteným v určitom rozpúšťadle, ktoré necháme odpariť a potom môžeme zmerať infračervené spektrum vzorky. Niektorí autori používajú tuto techniku aj na meranie látok rozpustných vo vode. Ako okienko používajú napr. ZnSe, Si nebo AgCl. Pre kvantitatívnu analýzu môžeme pri tejto technike použiť aj vnútorný štandard (napr. KSCN). Ten však musí byť homogénne rozptýlený vo vzorke, nesmie reagovať s analyzovanou vzorkou.
-
Pevné vzorky sú zomleté v malom vibračnom mlynčeku s KBr. Tento výsledný homogénny prášok je potom zlisovaný do tenkej tablety, ktorá je analyzovaná.
-
Ďalšou variantov je tzv. nujolová technika, v ktorej je prášková vzorka homogenizovaná s malým množstvom parafinového oleje a výsledná suspenzia je potom merená medzi dvomi KBr nebo NaCl okienkami vo forme tenkej vrstvy. Vzhľadom k tomu, že parafinový olej silne absorbuje v oblasti valenčných a deformačných vibrácií C–H väzieb, je meranie v Nujolu doplnené meraním v oleji Fluorolube, ktorý je polymérom –(CF2–CFCl)–. Nevýhodou tejto techniky je obťažné dosiahnutie rovnomernej hrúbky vrstvy a technika teda nie je vhodná pre kvantitatívnu analýzu.
-
Ďalšou možnosťou je použitie odrazových technik. Priehľadné tenké filmy, povrchové laky, fólie na lesklom kovovom podklade a rovné tenké výbrusy a leštené vzorky možno merať zrkadlovým odrazom známym pod názvom zrkadlový (spekulárny) odraz (reflektancia).
Naopak, pre vzorky s nerovným a nepravidelným povrchom alebo práškové látky je výhodné použitie difúzneho odrazu (reflektancie), ktorá je známa ako diffuse reflectance infrared Fourier transform spectroscopy (DRIFT). Oproti spekulárnej reflektancií je meraná difúzne rozptýlená zložka žiarenia.
UV VIS SPEKTROMETRIA
Molekulová absorpčná spektrometria v ultrafialovej a viditeľnej oblasti sa zaoberá meraním a interpretáciou elektrónových spektier molekúl látok, ktoré absorbujú elektromagnetické žiarenie v rozsahu vlnových dĺžok 200 až 800 nm. Spektrofotometriu v najjednoduchšom klasickom usporiadaní a pre viditeľnú oblasť nazývame kolorimetriou, prípadne fotometriou.
Látky, ktoré absorbujú len žiarenie s vlnovou dĺžkou menšou než 380 nm (ultrafialové žiarenie), sa prejavujú ako bezfarebné; látky ktoré absorbujú z bieleho slnečného žiarenia vlnové dĺžky v rozsahu 380 až 770 nm sa prejavujú ako farebné. Oblasť žiarenia s vlnovou dĺžkou menšou než 200 nm sa označuje ako „vákuová ultrafialová oblasť“. Na sledovanie absorpcie sa vyžadujú špeciálne evakuované aparatúry, pretože žiarenie je absorbované vzduchom.
Prístrojové vybavenie laboratória pre UV VIS spektrometriu
UV VIS Spektrofotometer Specord 200
UV VIS Spectrofotometer Specord 200 – oblasť merania od 190 do 1100 nm, spektrálne rozlíšenie ± 0,5 nm, fotometrická presnosť ± 0,004 A pri A = 1, stabilita základnej línie ± 0,001 A od 200 do 800 nm, rýchlosť skenovania až 6000 nm/min, Upravený kyvetový priestor umožňuje okrem merania kvapalín aj meranie tuhých vzoriek nujolovou technikou.
Teoretické základy UV VIS spektrometrie
Namerané elektrónové spektrum obsahujúce absorpčné pásy sa len zriedka môže použiť na získanie kvantitatívnych údajov o štruktúre molekuly v základnom stave. Často však zo spektier môžeme získať údaje o energii molekulových orbitálov.
Absorpcia svetelných kvánt molekulami sa riadi Lambertovým-Beerovým zákonom. Absorpčné spektrum je charakterizované energiou prechodu a intenzitou absorpčných pásov. Energia prechodu sa najčastejšie vyjadruje vlnovou dĺžkou l (v nm) alebo vlnočtom (v cm–1 alebo v mm–1). Intenzita pása sa často vyjadruje ako miera absorpcie v oblasti maxima pása, a to buď pomocou transmitancie T, absorbancie A alebo mólovým absorpčným koeficientom εmax. Použitie log ε pri elektrónových spektrách umožňuje na jednom spektre znázorniť pásy vo veľmi veľkom rozsahu intenzít.
Skupiny, ktoré zapríčiňujú absorpciu elektromagnetického žiarenia v ultrafialovej a viditeľnej oblasti, nazývame chromofory (z gréckeho nosič farby).
Auxochrómy sú organické skupiny, ktoré samotné nie sú chromofory, ale zvyšujú účinok chromoforov. Obsahujú voľný elektrónový pár, napr. OH, SH, NH2, halogény atď. V spojení s p-elektrónovými chromoformi spôsobujú posun absorpcie k väčším vlnovým dĺžkam. Batochrómny posun (červený posun) je posun k väčším vlnovým dĺžkam zapríčinený substituentom alebo rozpúšťadlom. Hypsochrómny efekt (modrý posun) je posun absorpcie k menším vlnovým dĺžkam vplyvom substituenta alebo rozpúšťadla.
Ako vyplýva z fyzikálnej podstaty vzniku ultrafialového spektra, poloha absorpčného pása závisí predovšetkým od typu prechodu, ktorému tento pás zodpovedá. Okrem tohto základného faktora ovplyvňuje polohu pása (najčastejšie vyjadrená vlnovou dĺžkou pri ktorej nastáva absorpcia), vlastná štruktúra molekuly ako aj interakcia molekuly s jej okolím v priebehu merania.
Absorpcia v UV alebo VIS oblasti je spôsobená prechodmi väzbových elektrónov v molekule z molekulových orbitálov s alebo p, príp. neväzbových elektrónov n, do protiväzbových molekulových orbitálov s* a p* (protiväzbové molekulové orbitály sa konvenčne označujú *). Vo väčšine zlúčenín sa vyskytuje viac chromoforov súčasne. To spôsobuje existenciu viacerých elektrónových prechodov a pozorované absorpčné spektrum je tvorené väčším počtom vzájomne sa prekrývajúcich pásov. Priradenie pásov elektrónovým prechodom príslušných skupín je však pre zložitú molekulu obťažné.
Výber techniky a príprava vzorky na UV VIS merania
Analytické využitie molekulovej absorpčnej spektrometrie v UV a VIS oblasti je mnohostranné ako v organickej tak aj anorganickej analýze. Na základe získaných spektier môžeme získať informáciu o prítomností typických skupín v molekule látok (kvalitatívne posúdenie štruktúry látok) alebo ich využiť na stanovenie látok. Identifikácia látky len na základe absorpčného spektra získaného v UV a VIS oblasti však obyčajne nie je jednoznačná. Aj tak však použitie atlasu spektier , spolu s aplikáciou základných pravidiel pre absorpciu žiarenia molekulami ako aj pri využití dát získaných inými metódami (IČ, NMR, hmotnostná spektrometria) umožňuje identifikáciu látok. Veľmi cenný je tento postup pri posudzovaní čistoty rôznych organických látok a pri identifikácií a štúdiu prakticky významných látok (v biochémii, farmakológii a pod.
Kvantitatívna anylýza
Pre kvantitatívne účely sa používa Lambert-Beerov zákon. Absorpciu žiarenia vo vzorke vystihuje Lambertov-Beerov zákon, ktorý možno písať v tvare:
F = F0 . 10^(– ε . c . l)
kde l je dĺžka dráhy lúča vo vzorke – hrúbka kyvety – najčastejšie udávaná v cm,
c - koncentrácia absorbujúcej zložky vo vzorke (mol×dm–3),
ε - mólový absorpčný koeficient pri vlnovej dĺžke l (dm3×mol–1×cm–1).
Základnou podmienkou pre jeho platnosť je aby látkou absorbovaná energia sa menila na energiu tepelnú a tá bola potom uvoľňovaná len kolíznymi deaktiváciami. To znamená, že nesmie dochádzať k fluorescencii alebo rozptylu žiarenia na koloidných časticiach v roztoku a index lomu meraného roztoku musí byť konštantný. Uvedené platí len pre zriedené číre roztoky absorbujúcich látok s koncentráciou menšou ako 10–2 M.
Hodnota absorbancie A (= log (Φ0 / Φ) ) je teda lineárnou funkciou koncentrácie
A = Σ ε . c . l
Lambertov-Beerov zákon je základom pre kvantitatívnu analýzu založenú na meraní absorpcie žiarenia. Absorbancia A je aditívna veličina. V zmesi vypočítame A pri danej vlnovej dĺžke ako súčet jednotlivých zložiek
A = Σ εi . ci . l
Z uvedeného vyplýva, že absorpcia žiarenia jednou zložkou nie je ovplyvnená prítomnosťou ďalších zložiek. Lambertov-Beerov zákon platí len pre zriedené roztoky. V praxi treba často brať do úvahy faktory, spôsobujúce odchýlky od linearity A = f(c).
Hodnotenie presnosti merania absorbancie alebo priepustnosti vychádza z Lambert-Beerovho zákona a veľkosť relatívnej chyby merania hodnoty koncentrácie sa hodnotí na základe zmeny priepustnosti (alebo absorbancie) s koncentráciou. Veľkosť relatívnej chyby merania koncentrácie v závislosti na hodnotách T (resp. A) sa príliš nemení v rozsahu T = 20 až 60%, čo odpovedá A = 0,15 až 0,70. Meranie možno ešte s dostatočnou presnosťou uskutočniť v rozsahu T = 10 až 80% (A = 0,1 až 1,0). Pre hodnoty T < 10% alebo T > 80% veľkosť chyby prudko vzrastá.
Látka, ktorá má vo svojej molekule skupiny schopné absorpcie UV alebo VIS žiarenia poskytuje po rozpustení vo vhodnom rozpúšťadle viac alebo menej zložité spektrum. V prípade anorganických alebo organických zlúčenín, ktoré majú nízke hodnoty ε (101 až 102 l mol–1 cm–1), sú metódy využívajúce stanovenie vzorky meraním ich spektier málo citlivé.
Pre stanovenie väčšiny anorganických i organických látok v oblasti viditeľného žiarenia je nutné najprv tieto látky previesť na farebné produkty pomocou tzv. spektrometrických reakcií. Sú to napr. reakcie tvorby farebných komplexov.
Pre stanovenie tuhých látok je absorpčná spektrofotometria použiteľná iba na meranie transparentných vzoriek. V ostatných prípadoch je možné použitím vhodného príslušenstva (sústavy zrkadiel) uskutočniť meranie odrazeného žiarenia (reflektancie) skúmanej vzorky.
